一、RNA干涉在肿瘤研究中的应用进展（论文文献综述）
王海洋[1]（2020）在《三氧化二砷抑制肝癌转移及肝癌干细胞的作用与机制研究》文中研究指明全球肝细胞癌的每年新发病例数约为84万,而死亡病例则高达每年78万,其肿瘤相关死亡率在恶性肿瘤中排名前三。这不仅由于晚期肝癌向远端转移的倾向更高,有效治疗手段和药物的缺乏也是导致其不良预后的主要原因。寻找对晚期肝癌安全有效的治疗方案是肝癌研究中亟待解决的难题。在不断探索新的分子靶向药物和免疫治疗的同时,“老药新用”的策略不失为一个更具疗效指向性、更低成本、更高成功率的探索思路。在晚期肝癌的临床研究中,传统中药三氧化二砷（Arsenic Trioxide,ATO）的经验性使用最终被证实疗效显着便是一个成功的案例。三氧化二砷是被中国及美国FDA批准的治疗急性早幼粒细胞白血病（Acute Promyelocytic Leukemia,APL）的一线用药,由于其作用靶点明确,作用方式直接,使得这一血液系统恶性肿瘤得到了高达90%的治愈率。在后续诸多实体瘤的临床试验中,三氧化二砷对晚期肝癌患者表现出了良好的治疗效果。但与其在白血病中的作用机制非常明确不同,三氧化二砷对晚期肝癌的作用靶点及其机制尚未得到阐明,这在一定程度上限制了其应用的安全性和疗效的提高。由于晚期肝癌通常伴有转移,肿瘤细胞侵犯门静脉、局部淋巴结,或远端器官。而越来越多的研究表明转移发生的元凶是肿瘤组织中的一小群处于更高层级的、具有高度自我更新及多向分化能力的、可以在转移部位重建肿瘤组织的肿瘤细胞,这一小群细胞被定义为“肿瘤干细胞”（Cancer Stem Cells,CSCs）。根据三氧化二砷的分子特性和临床经验性使用的疗效特征,我们推测三氧化二砷在晚期肝癌的治疗作用可能与抑制肝癌干细胞有关。因此,本研究主要围绕三氧化二砷是否抑制肝癌干细胞以及如何调控肝癌干细胞等系列问题展开探索。首先为了论证三氧化二砷是否对肝癌干细胞发挥调控作用,我们利用多种动物模型,包括小鼠皮下成瘤模型、二次移植模型及肝脏原位荷瘤肺转移模型,考察三氧化二砷对肝癌干细胞体内功能的影响。结果显示三氧化二砷可以在动物体内抑制肝癌干细胞介导肿瘤启动、肿瘤复发及远端转移的能力,甚至可以在肝癌肺转移小鼠模型中将小鼠的中位生存时间从32天延长至41天,显着改善小鼠生存状态;之后我们利用多个肝癌细胞系,以及通过肿瘤干细胞表面标志富集或通过肿瘤成球富集得到的肝癌干细胞样细胞,进一步探究了三氧化二砷在体外对肝癌干细胞相关表型及功能的作用,包括流式细胞术检测肿瘤干细胞表面标志、实时定量PCR检测干性基因的表达,耐药性质、肿瘤干细胞球形成能力以及Transwell侵袭能力的评估等。最终证实了三氧化二砷可以抑制肝癌干细胞相关的多种特性与功能。在上述结论的基础上,为了探讨三氧化二砷发挥作用的分子机制,我们进一步利用高通量基因芯片检测,筛选鉴定三氧化二砷作用于肝癌细胞的生物靶分子。我们发现三氧化二砷显着下调肝癌细胞微小染色体维持蛋白7（Minichromosome maintenance protein 7,MCM7）的表达,这一下调作用在多个肝癌细胞系以及小鼠皮下肿瘤原位注射模型中均得到验证;然而MCM7是否是介导三氧化二砷对肝癌干细胞作用的关键靶分子?我们进一步利用MCM7低表达的肝癌细胞株,重复了上述小鼠肝脏原位荷瘤肺转移实验及部分体外实验,发现MCM7的下调表达可使肝癌肺转移率从64.7%下降至30%,且显着抑制肝癌干细胞在体外的相关表型与功能,证实了MCM7对肝癌转移及肝癌干细胞的重要调控作用。而MCM7在肝癌细胞中的过表达则可抵消三氧化二砷对肝癌干细胞成球的抑制作用,从而明确了MCM7是介导三氧化二砷作用的关键分子。在此基础上,我们还对以上研究结果进行了临床验证,将80例肝癌患者的肿瘤组织及癌旁组织进行MCM7的免疫组化染色,发现MCM7在考察的所有患者的肝癌组织中都较癌旁组织呈显着的核内高表达,并且MCM7的表达水平与肝癌进展及预后密切相关。这一结论为解释三氧化二砷的临床治疗效果提供了新的理论依据,对指导三氧化二砷更精准高效的应用也具有重要的意义。最后,为了明确三氧化二砷对MCM7分子的调控机制,我们利用免疫沉淀技术阐明了在肝癌细胞中存在血清反应因子（serum response factor,SRF）/MCM7复合物,以及该复合物通过SRF与MCM7启动子区结合调控MCM7转录的现象;利用有机砷荧光探针与MCM7蛋白芯片反应,确定了三氧化二砷的直接作用靶点为MCM7蛋白;双荧光素酶报告系统进一步阐明三氧化二砷通过抑制SRF/MCM7复合物对MCM7的转录进行调控,从而下调MCM7的表达。综上,我们的研究证实了三氧化二砷通过下调MCM7分子对肝癌转移及肝癌干细胞发挥抑制作用;阐明了三氧化二砷对MCM7的下调是通过与MCM7结合进而抑制SRF/MCM7复合物对MCM7转录调控而实现的。此系列研究结果为三氧化二砷在晚期肝癌的临床应用提供了新的理论支持,为指导其更加安全、科学、精准、高效的使用奠定了基础,同时也为针对MCM7分子及其调控通路的新药筛选提供了重要线索。
姚洲[2]（2020）在《以AKR1C3为靶点的核酸纳米粒子的构建及其靶向抑制去势抵抗性前列腺癌的实验研究》文中研究指明前列腺癌在全球男性中是一种常见重大的临床问题,在西方发达国家,癌症发病率第一,死亡率第二。在我国,随着人口老龄化和饮食结构的改变,前列腺癌的发病率逐年递增,已经是严重危害我国中老年男性健康的常见恶性肿瘤。经雄激素剥夺治疗（ADT）后前列腺癌不可避免会进展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）,其主要机制是雄激素信号通路直接或间接被再次激活。醛-酮还原酶3（AKR1C3）位于雄激素合成通路的终末端,是肿瘤细胞内合成睾酮和双氢睾酮最后两个步骤的关键酶。因此,AKR1C3是ADT后肿瘤细胞自身获得雄激素合成能力的关键酶,是再次激活雄激素信号通路促进前列腺癌进展为CRPC关键因素。将AKR1C3作为防治CRPC的靶标,通过下调AKR1C3的表达,减少前列腺癌细胞内自身雄激素的合成,是预防和治疗CRPC的新策略。近年研究出多种AKR1C3抑制剂,已经取得一定进展,但因组织选择性低、抑制作用特异性差和毒性大等缺点,而使其临床应用前景不容乐观。因此,研发肿瘤组织特异性的AKR1C3抑制剂成为亟需解决的问题。RNA干涉技术和靶向纳米输送系统的发展为上述问题的解答提供了可能。目的:制备靶向纳米输送系统与RNA干涉技术相结合的核酸纳米粒子,具有前列腺癌细胞靶向性,并抑制AKR1C3蛋白而下调细胞增殖。对核酸纳米粒子的特性进行表征,并在细胞水平评价该核酸纳米粒子的稳定性、靶向性与有效性,以及核酸纳米粒子有效性的作用机制做初步探索。方法与结果:⑴实验以PAMAM和PEG构成正电子性聚合物纳米材料载体,表面连接PSMA-aptamer使其具有前列腺癌细胞靶向性,成功合成靶向性核酸纳米载体,通过结合有效下调蛋白量的AKR1C3-si RNA,成功构建前列腺癌细胞靶向性抑制AKR1C3蛋白的核酸纳米粒子（PAMMA-PEG-PSMA-aptamer/AKR1C3-si RNA）,并对其进行表征。通过体外细胞毒性实验（SRB）筛选纳米材料载体组分的适宜比例,通过琼脂糖凝胶电泳实验,探索核酸纳米粒子载体与si RNA静电结合比例,以PAMAM-PEG-PSMA-aptamer=1:1.5:0.5,N/P=40合成靶向核酸纳米粒子。通过核磁共振氢谱鉴定核酸纳米粒子成分,合成后,材料PAMAM和PEG特征峰存在,且有MAL基团峰,可与PSMA-aptamer结合。透射电镜观察核酸纳米粒子形貌基本为圆形。测定粒径和电位检测核酸纳米粒子特性,电位随着合成的增加而变小,趋近于0m V;粒径在PAMAM结合PEG后增加,但在合成PSMAaptamer和载si RNA后出现紧缩状态,粒径逐渐减小至453.9nm左右。⑵基于成功合成的前列腺癌靶向性核酸纳米粒子（PAMMA-PEG-PSMAaptamer/AKR1C3-si RNA）,于细胞水平检测其靶向性和有效性,结果表明,核酸纳米粒子靶向PSMA阳性前列腺癌细胞,且具有时间和浓度依赖性,当浓度不变时,胞吞4h比1h入细胞的药物更多,在相同胞吞时间内,随着浓度增加,胞吞入细胞的药物量逐渐增加。模拟去势抵抗性前列腺癌环境,构建去势环境下的高表达AKR1C3的LNCa P细胞。SRB法检测细胞增殖,转染AKR1C3质粒后,提高LNCa P细胞增殖率为26.58±13.41%,在核酸纳米粒子作用下,抑制细胞增殖,LNCa P细胞增殖抑制率为22.31±7.64%,22RV1细胞增殖抑制率为4.47±2.3%。Ed U流式实验检测细胞增殖,转染AKR1C3质粒后,提高LNCa P细胞增殖率为83.52±11.38%,在核酸纳米粒子作用下,抑制细胞增殖,LNCa P细胞增殖抑制率为36.49±1.07%,22RV1细胞增殖抑制率为52.07±13.84%。核酸纳米粒子在抑制细胞增殖时,显着下调AKR1C3蛋白和cyclin D1蛋白,LNCa P细胞内分别下降71.44%和54.56%,22RV1细胞内分别下降22.24%和31.84%,所以,可见核酸纳米粒子通过下调AKR1C3蛋白有效抑制前列腺癌细胞的增殖。结论:采用纳米医学和RNA干涉技术相结合,成功构建以AKR1C3为治疗靶标,前列腺癌靶向特异性si RNA干涉体系（PAMMA-PEG-PSMA-aptamer/AKR1C3-si RNA）,并于细胞水平验证其安全性,其有效抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的增殖。本研究将为AKR1C3-si RNA的创新应用及CRPC的治疗提供理论基础和实验依据。
荆琳[3]（2019）在《细胞程序性坏死抵抗参与肺癌顺铂耐药的机制研究》文中认为研究背景和目的:癌症是全球最主要的公共卫生问题。肺癌的发病率和死亡率在众多类型的癌症中一直位居前列,是对人类健康威胁最大的肿瘤之一。化疗是肺癌治疗的重要手段,而顺铂目前仍作为肺癌治疗的一线用药被广泛使用。对顺铂细胞毒性机制以及耐药机制的研究由来已久,现如今程序性坏死这一新的细胞程序性死亡形式的出现,给顺铂相关机制的研究带来了新的方向。已有研究表明,顺铂可以诱导细胞发生程序性坏死,但能否通过诱导程序性坏死杀伤肺癌细胞仍无报道。众所周知,细胞凋亡抵抗是顺铂耐药的重要机制,细胞程序性坏死抵抗是否促进肺癌细胞对顺铂产生耐药目前却并不完全清楚。本课题拟针对以上两个关键问题进行研究。本课题分为三个部分:第一部分,顺铂诱导肺癌细胞程序性坏死及机制研究研究方法:1)光镜或电镜观察死亡细胞情况与形态;2)MTT法、LDH释放实验和流式细胞术检测药物处理的细胞毒性;3)Western blotting检测相关分子蛋白水平的改变;4)q-PCR检测相关分子mRNA水平的改变;5)细胞免疫荧光染色检测药物处理后相应分子表达或分布的改变;6)ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α含量;7)免疫组织化学染色检测肺癌组织中p-MLKL的表达;8)PI及Hoechst染色检测细胞死亡;9)免疫共沉淀检测细胞内蛋白质的相互作用。研究结果:我们检测了五株肺癌细胞系RIPK3的表达水平,发现A549细胞中RIPK3表达量最高。运用zVAD抑制细胞凋亡后,顺铂仍能诱导A549细胞死亡,死亡的细胞呈现程序性坏死的特点。程序性坏死抑制剂Nec-1及NSA可以抑制顺铂诱导的A549细胞死亡。通过免疫共沉淀的方法我们证实了顺铂处理的A549细胞中RIPK1、RIPK3以及MLKL可形成复合物,且顺铂处理后A549细胞中p-MLKL表达升高。肺癌患者临床样本免疫组织化学染色的结果显示术前运用新辅助化疗（化疗方案中包括顺铂）的肺癌组织的p-MLKL表达水平高于直接手术组的患者。我们发现顺铂处理后A549细胞中TNF-α表达水平升高且顺铂可促进A549细胞TNF-α自分泌。运用TNF-α中和抗体预处理细胞可以减轻顺铂诱导的程序性坏死。结论:顺铂可以诱导肺癌A549细胞发生程序性坏死。第二部分,PITPα与MLKL相互作用参与调控程序性坏死研究方法:1)免疫共沉淀检测细胞内蛋白质的相互作用;2)荧光共振能量转移实验检测活细胞内两分子的直接相互作用;3)非还原SDS-PAGE检测细胞内MLKL寡聚体形成;4)分离浆蛋白与膜蛋白检测MLKL的膜定位情况;5)RNAi技术检测PITPα对MLKL功能的影响;6)利用细胞免疫荧光染色检测MLKL在细胞内的分布情况;7)MTT法检测实验处理的细胞毒性;8)Western blotting检测相关蛋白表达情况。研究结果:我们发现,A549细胞中MLKL与PITPα可发生直接的相互作用。将MLKL分子截短表达后,我们利用荧光共振能量转移实验证实了MLKL的N端结构域与PITPα发生相互作用。根据RossetaDock获得的MLKL-PITPα复合体模型,我们构建了双点突变的MLKL突变体并证实突变体MLKLQ135P/Q138P与PITPα的结合能力下降。干涉PITPα影响了HEK-293T细胞中过表达的MLKL的膜转位与寡聚体形成。干涉PITPα也可影响顺铂处理的A549细胞中MLKL的膜转位与寡聚体形成。干涉PITPα可以减轻过表达MLKL引起的HEK-293T细胞死亡以及顺铂诱导的A549细胞死亡。结论:PITPα是MLKL的相互作用分子并且可参与调控程序性坏死。第三部分,程序性坏死抵抗促进肺癌细胞顺铂耐药及调控机制研究研究方法:1)CCK-8法、LDH释放实验和流式细胞术检测药物处理的细胞毒性;2)Western blotting检测相关分子蛋白水平的改变;3)q-PCR检测相关分子mRNA水平的改变;4)RNAi技术检测相关分子在细胞死亡信号通路中的作用;5)免疫共沉淀检测细胞内蛋白质的相互作用。研究结果:我们发现RIPK3分子在耐药细胞株A549/DDP细胞中表达低于亲本细胞,且A549/DDP细胞对于顺铂诱导的程序性坏死不敏感。过表达RIPK3后,A549细胞和A549/DDP细胞对顺铂诱导的细胞死亡敏感性增加,顺铂也可以诱导A549/DDP细胞发生程序性坏死。我们证实了肺癌细胞RIPK3的表达受到CNOT3的负向调控。对于A549/DDP细胞而言,细胞中CNOT3蛋白表达上调促使了其RIPK3的表达量低于亲本细胞。此外,我们还发现CNOT3的表达水平与肺癌细胞对顺铂的敏感性呈负相关。干涉CNOT3后,顺铂处理的细胞中外源性凋亡通路激活,凋亡细胞数量增加,而这一过程依赖表达上调的RIPK3对FADD和Caspase 8更多的募集。通过分析数据库中的数据,我们发现肺癌组织中CNOT3 mRNA表达量高于正常肺组织,而其高表达与肺癌患者的不良预后相关。除此之外,CNOT3参与调控肺癌细胞的增殖。结论:1、RIPK3表达下降导致的程序性坏死抵抗是肺癌细胞顺铂耐药的机制之一;2、CNOT3负向调控RIPK3表达,干涉CNOT3可使耐药细胞对顺铂诱导的凋亡敏感性增加。
李帅洪[4]（2019）在《GADD45α抑制大鼠肝癌细胞CBRH-7919增殖的作用机制研究》文中进行了进一步梳理生长停滞和DNA损伤诱导45α（GADD45α）是应激诱导蛋白,在细胞存活、死亡、染色质组装、基因组稳定性和DNA损伤修复中具有重要的作用,GADD45α表达的蛋白通过MTK1/MEKK4激酶介导p38/JNK途径的激活来响应环境胁迫。GADD45α转录表达方式由p53依赖性和非依赖性两种机制介导。本文通过生物信息学分析,发现GADD45α基因在多种癌组织中低丰度表达,GADD45α在癌组织和癌旁组织的表达水平具有显着性差异。但当DNA损伤、环境胁迫等不利因素导致肝病、肝癌的发生过程中,GADD45α的表达却异常突增。通过TCGA肿瘤数据库对肝癌样本进行分析发现,GADD45α高表达的患者生存率较高,复发和转移较低。一些证据初步表明,GADD45α在肝癌发生发展的过程中起着重要的作用。因此本文以大鼠肝癌细胞CBRH-7919为实验材料,以及MC-LR连续低浓度恶化处理的大鼠肝细胞BRL-3A细胞为主要实验材料。进行探究GADD45α在肝癌发生发展过程的具体功能和调控的分子机制。本文通过GADD45α基因过表达和siRNA敲降基因等实验方法,通过MTT检测细胞活力,研究发现GADD45α过表达可以抑制肝癌细胞的活力。EDU检测细胞增殖,结果表明过表达抑制了肝癌的细胞增殖,侵袭和转移结果表明,GADD45α过表达减缓了细胞的侵袭和转移,而干涉GADD45α的表达则促进了肝癌细胞的侵袭和转移进程。通过流式细胞术检测细胞的周期和凋亡,研究发现,GADD45α过表达的肝癌细胞能够显着的阻滞细胞周期的进程,促进细胞的凋亡。而敲降GADD45α的表达则会促进细胞的周期进程,抑制细胞的凋亡。通过IPA、KEGG等在线网站分析绘制了GADD45α可能发挥作用的信号通路图。通过qRT-PCR、Western-blot结果表明:P38、JNK、MAPK、AKT等信号通路基因和蛋白水平发生了显着的变化。GADD45α可能通过P38、JNK、MAPK、AKT等相关信号通路,在肝癌细胞的发生发展过程中发挥具体的调控机制。
李菁[5]（2017）在《TNK2基因剪接异构体variant 1的表达变化影响乳腺癌癌性进展》文中研究指明乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤,发病人群中99%为女性,且发病率呈逐年上升趋势。国际乳腺癌会议综合乳腺癌分子表达和临床特征,将其分为5种亚型,方便临床诊治和基础研究。乳腺癌的发生发展、转移浸润及预后情况与多种癌基因突变或异常表达有关。在分子水平上定位特定的原癌基因或抑癌基因,是目前最具靶向研究和诊治乳腺癌的切入点。TNK2基因因其非受体酪氨酸激酶活性,在乳腺癌早期筛查、靶向治疗和预后评价中获得了不少的关注,因此作为本研究所选用的目标基因。为了更加精准了解基因表达变化对乳腺癌发展进程有哪些影响,本研究关注了更加细化基因表达情况的基因选择性剪接调控机制。通过对比TNK2基因全基因表达变化和个别剪接异构体表达变化的情况,分析乳腺癌中高表达的TNK2基因剪接异构体在乳腺癌发生发展中的生物学作用,主要研究结果如下:1.合成TNK2基因剪接异构体特异性引物,利用RT-PCR方法在正常乳腺上皮细胞和四种不同表型的乳腺癌细胞系中扩增TNK2基因剪接异构体。比较其表达情况,发现TNK2基因剪接异构体1（Variant 1）在乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T-47D细胞中呈异常高表达,确定MDA-MB-231和T-47D细胞用于后续研究。2.设计合成特异性干涉TNK2基因Variant 1和总TNK2表达的siRNAs,分别转染到MDA-MB-231和T-47D两种乳腺癌细胞系中,收集细胞后RT-PCR扩增TNK2基因mRNA,确定siRNAs可有效下调总TNK2及其Variant 1剪接异构体的表达水平。3.应用MTT细胞活力检测法、BrdU掺入法、流式细胞术和Western blot法,证实siRNA干涉TNK2基因Variant 1和总TNK2表达后,乳腺癌细胞的增殖受到了抑制,细胞周期阻滞在G1/S期;应用划痕检测法、Transwell小室法和Western blot法,证实TNK2基因Variant 1和总TNK2的表达下调后,乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力明显受到了抑制,同时这可能与抑制EMT和迁移侵袭有关的分子表达有关;应用平板克隆实验和软琼脂集落形成实验,证实抑制TNK2基因Variant 1和总TNK2表达后,乳腺癌细胞的克隆形成能力明显受到了抑制。4.应用DAPI免疫荧光法、流式细胞术和Western blot法检测细胞的凋亡情况,证实TNK2基因Variant 1和总TNK2的表达降低,并没有诱导乳腺癌细胞发生凋亡现象。结合实验结果分析,siRNAs干涉TNK2基因Variant 1的表达后对乳腺癌细胞增殖、迁移和克隆形成等转化特性所产生的抑制作用,强于或近似于干涉总TNK2表达后产生的影响,说明TNK2对部分乳腺癌生物学特性的调控作用主要是TNK2基因Variant 1介导的。
高扬[6]（2011）在《RNA干涉抑制STAT3基因诱导口腔鳞癌细胞发生凋亡的体内外实验研究》文中认为口腔鳞癌是口腔部位及周边最为常见的恶性肿瘤,其发病率占到口腔部位肿瘤总发病率的80%以上,是值得引起人们高度关注和重视的恶性疾病之一。虽然在欧美等发达国家口腔鳞癌的发病率有所下降,但在全世界范围内发病率仍然呈现上升趋势。近年来随着医疗水平的不断提高,许多恶性肿瘤的治疗方面取得了不小的进步,通过治疗提高了患者的5年生存率。但在口腔鳞癌的治疗方面,由于此疾病的发生早期不易被患者察觉等特殊性,致使该疾病的治疗滞后,癌症晚期的治疗难度加大。因而有必要加大对口腔鳞癌治疗的关注度,寻找出口腔鳞癌的更好的治疗方法。口腔鳞癌的治疗方面,常规的治疗方法包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、免疫治疗等。这些治疗方法虽然在一定程度上会抑制肿瘤的发生发展,但又存在较大的治疗弊端。例如放疗、化疗会不可避免的引起严重副反应而手术治疗存在操作不易进行等特点,单纯手术治疗无法根治肿瘤等方面的缺陷。免疫治疗的疗效并不明显。而基因治疗和分子靶向治疗为近年来新兴的肿瘤治疗手段,由于其副反应小、疗效确切等方面的优势得到了科研工作者的青睐。基因治疗中的RNA干涉技术为近年来新兴的疾病诊疗技术,找到疾病致病的相关靶基因,对其进行干预可有效的阻止疾病的进程,尤其在肿瘤治疗中越来越多的引起人们的关注。STAT3基因为信号转导活化因子3的编码基因,其常被视为原癌基因。STAT3信号传导通路的下游通路可影响许多推进肿瘤进程的相关因子的表达,诸如cyclinD1、Bcl-xl、survivin、c-myc等因子。此外STAT3还参与了肿瘤的免疫逃逸过程,因而将STAT3基因作为肿瘤基因治疗的靶点,对其进行相应的干预,可成为肿瘤治疗的有效手段。本研究正是利用了基因治疗中的RNA干涉疗法,将肿瘤相关的癌基因STAT3作为治疗靶点,设计了针对STAT3基因位点的RNAi质粒,将质粒导入口腔鳞癌细胞,首先在体外观察该质粒的RNA干涉效应对口腔鳞癌进程的影响,之后利用口腔鳞癌动物模型进行相关的动物体内实验,验证RNAi对STAT3基因进行干预后所产生的肿瘤抑制效果。本研究对口腔鳞癌的治疗方法进行了全新的探索,有望通过本研究开辟出口腔鳞癌治疗的新途径。目的:探讨通过RNA干涉技术对STAT3基因进行敲除对口腔鳞癌细胞造成的体外抑制以及对口腔鳞癌动物模型的抑瘤效果。方法:（1）应用免疫组化方法检测正常口腔黏膜组织、不典型增生组织及口腔鳞癌组织中STAT3、EGF及EGFR蛋白的表达。（2）应用基因重组技术构建出STAT3基因的干扰质粒,即psilencer1.0- U6-stat3-siRNA质粒。（3）应用基因工程下游技术,诸如Western blot、RT-PCR、免疫组化等方法在体外和体内对不同实验分组的口腔鳞癌肿瘤细胞的STAT3 mRNA表达水平及相关蛋白的表达情况进行检测,判断RNAi的抑瘤效果。（4）体外实验:针对RNAi的干扰位点设计STAT3的siRNA模板,在体外成功设计并合成出该模板,对质粒载体进行酶切,使其线性化并进行回收。之后对样本进行核算定量。利用T4连接酶将线性质粒载体同干扰片段进行连接。之后进行感受态细胞的制备,再将重组质粒同感受态细胞共同孵育,进行质粒对感受态细胞的转化。要进行重组质粒的提取与鉴定。之后进行重组质粒对细胞的转染。转染要按照如下的方式进行实验分组,实验分为四组,包括阳性重组质粒实验组;阴性重组质粒对照组;空白质粒对照组;空白溶剂对照组。实验分组的相应实验完成后,进行相关体外实验对各组STAT3相关蛋白表达的抑制情况进行检测。制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,经过蛋白质的电转移,封闭,抗体的结合,显色照相等步骤完成免疫印迹实验;对转染细胞的总RNA进行提取,经RNA定量,cDNA的获取及逆转录反应,引物合成,聚合酶链式反应,PCR产物的检测等步骤对STAT3 mRNA的表达情况进行检测;利用流式细胞仪对实验细胞的凋亡情况进行检测;配置比色试剂,对细胞进行胰蛋白酶的酶解,进行显色、比色等步骤对细胞凋亡情况进行MTT法的相关检测。（5）体内实验:将人Tca8113舌鳞癌细胞重悬培养后对裸鼠进行背部的接种,建立人舌鳞癌的裸鼠动物模型,待肿瘤体积增长到50mm3后模型建立成功。之后利用电转染的方法将psilencer1.0-U6-stat3-siRNA重组质粒及空白质粒、对照质粒转入肿瘤组织的癌细胞内。定期对肿瘤的生长情况进行检测,定期检测各组裸鼠肿瘤体积的增长速度并在实验结束后取下肿瘤,对肿瘤的重量进行测定。利用RT-PCR方法检测STAT3基因的mRNA表达情况,利用western blot方法检测STAT3及其相关基因MMP2、VEGF的蛋白表达情况,利用免疫组化方法检测STAT3及其相关基因BAX、BCL-2的表达情况。结果:（1）免疫组化研究结果显示:口腔鳞癌癌变过程中STAT3蛋白表达在正常黏膜组织、不典型增生组织及癌组织中的表达率依次增高,分别为13.3%（8/60）、30.0%（9/30）、71.2%（43/60）组间比较差异有统计学意义（P<0.05）;而EGF蛋白在正常口腔黏膜组织、不典型增生组织及口腔鳞癌组织中的表达率分别为25.0%（15/60）、46.7%（14/30）、76.7%（46/60）,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）;EGFR在正常黏膜组织、不典型增生组织及癌组织中的表达率分别为15.0%（9/60）、36.7%（11/30）、70.0%（42/60）,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）,三者呈正相关关系。口腔鳞癌组织中STAT3蛋白表达与癌的组织学分级、浸润深度及淋巴结转移密切相关（P<0.05）; EGF及EGFR蛋白表达均与癌的组织浸润深度及淋巴结转移密切相关（P<0.05）。（2）经相关的酶切检定,检测出了psilencer1.0-U6-stat3-siRNA质粒构建成功。（3）体外实验的实验结果:研究结果表明,实验组重组质粒对舌鳞癌细胞具备较强的促细胞凋亡和增殖抑制作用;Western blot的实验结果和逆转录PCR的实验结果均显示重组质粒对细胞的增殖产生抑制效果,对细胞的凋亡产生促进效果,为了验证重组质粒的促凋亡、抑制增殖的分子机制,特进行了MTT实验和流式细胞仪检测细胞周期实验。MTT实验的结果显示重组质粒可明显的抑制细胞的增殖,而流式细胞仪实验则显示重组质粒将细胞周期阻断在G0/G1分期,在正常2倍体峰之前出现了亚二倍体峰,具备较高的凋亡率。（4）体内实验的实验结果:成功的构建出口腔鳞癌裸鼠皮下移植瘤动物模型,实验组动物的肿瘤体积增长速度明显小于其他对照组肿瘤体积的生长速度（p<0.05）。实验组动物肿瘤的最终体积要明显小于各对照组动物肿瘤的最终体积（P<0.05）。RT-PCR检测STAT3基因mRNA的表达情况显示实验组的STAT3 mRNA的表达水平要明显高于对照组（P<0.05）,western blot方法检测STAT3及其相关基因MMP2、VEGF的蛋白表达情况显示实验组的蛋白表达量要明显的低于对照组（P<0.05）,免疫组化方法检测STAT3及其相关基因BAX、BCL-2的表达情况显示实验组的相关蛋白表达量要明显低于对照组（P<0.05）。结论:（1）STAT3、EGF及EGFR在口腔鳞癌的浸润、转移及粘膜上皮癌变过程中起着重要作用,提示联合检测STAT3、EGF及EGFR可望成为口腔鳞癌早期诊断和判断预后的客观指标之一。（2）涉及STAT3的siRNA基因阻断质粒,成功进行细胞转染后,可有效的抑制口腔鳞癌细胞中STAT3信号传导通路的激活和信息传递。信号传导通路的抑制又使肿瘤细胞的细胞周期被阻断,诱导口腔鳞癌细胞的体外凋亡。该结论提示可将STAT3 siRNA作为口腔鳞癌的治疗分子。（3）体内实验的实验结果表明,成功的转染STAT3 siRNA质粒进入实验模型的肿瘤部位后可有效的抑制肿瘤体积的增长。对STAT3基因表达的抑制可致使该信号通路下游的MMP-2及VEGF分子的表达被抑制,这提示对STAT3信号通路抑制,可间接抑制MMP-2、VEGF等肿瘤相关基因的表达,进而抑制肿瘤的发生与发展。
左丹[7]（2009）在《靶向VEGF基因的siRNA对HeLa细胞中VEGF表达和细胞增殖的影响》文中进行了进一步梳理血管生成是肿瘤发生、发展的必要过程,与肿瘤的生长、转移等有着密切的关系。许多生长因子是血管生成的潜在正调节因子,其中血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factor,VEGF）是最重要的血管生成诱导因子之一,能直接或间接参与血管生成,以促进肿瘤血管新生的方式促进肿瘤的生长,而且还可以自分泌的方式促进肿瘤细胞的自身生长。因此,VEGF在恶性肿瘤的发生、发展及预后中具有极其重要的地位。研究发现,VEGF在多种肿瘤组织中都有高表达,如宫颈癌。因而通过干涉VEGF表达影响肿瘤的血液供应从而抑制肿瘤生长可能成为宫颈癌基因治疗的潜在靶点。RNA干涉是指以双链RNA（dsRNA）作为识别信号,引发同源mRNA特异序列的降解,并导致转录后基因沉默的一种机制。RNA干涉技术为高特异性基因沉默研究提供了一个新的思路。本研究选用高表达VEGF的宫颈癌细胞系HeLa细胞,利用靶向VEGF基因的RNA干涉质粒转染HeLa细胞,建立稳定表达VEGF siRNA的细胞株,探讨RNA干涉对HeLa细胞中VEGF的表达和细胞增殖的影响。实验结果证实,VEGF siRNA可以有效抑制HeLa细胞中VEGF mRNA和蛋白的表达,抑制细胞的增殖。表明:VEGF在宫颈癌的发生发展中具有重要作用,抑制VEGF的表达有望成为一种治疗宫颈癌的有效途径。
王海涛[8]（2009）在《RNA干涉沉默CXCR4基因对喉癌侵袭、转移的相关性实验研究》文中研究说明目的:检测趋化因子受体（CXCR4）在喉癌组织中的表达,探讨CXCR4在喉癌发生及发展中的作用;应用RNA干涉技术沉默CXCR4基因,研究CXCR4基因沉默后对喉癌Hep-2细胞株增殖、凋亡、粘附和侵袭的影响。方法:1.应用免疫组织化学SP法检测CXCR4在喉癌组织、癌旁组织、对照组中的表达。2.应用分子生物学技术,模拟内源性miRNA,设计CXCR4基因的shRNAmir,用酶切鉴定、测序检测重组质粒。3.重组质粒用脂质体Lipofectimine 2000转染人喉癌Hep-2细胞。应用免疫组化SP,半定量RT-PCR检测转染后Hep-2细胞中CXCR4蛋白与mRNA的表达水平。4.四甲基偶氮唑盐（MTT）检测转染的重组质粒对喉癌Hep-2细胞体外增殖的影响。5.流式细胞术检测转染的重组质粒的喉癌Hep-2细胞体外凋亡情况。6.半定量RT-PCR检测转染的重组质粒对血管内皮生长因子VEGF与细胞间粘附分子E-CD的mRNA表达水平。7.体外粘附实验检测转染的重组质粒对Hep-2细胞体外与基质粘附能力的影响。8.Transwell小室体外侵袭实验检测转染的重组质粒对Hep-2细胞体外侵袭能力的影响。结果:1.CXCR4蛋白在喉癌组织中呈强阳性表达,蛋白表达水平显着高于对照组（P<0.01）;在中低分化、淋巴结转移组蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）。2 .构建的重组质粒（ pCXCR4miR/GFP-262、pCXCR4miR/GFP-713、pCXCR4miR/GFP- 961）经酶切鉴定、测序比对后证明所构建的重组质粒成功。3.转染后免疫组化SP检测到72小时后3个重组质粒（pCXCR4miR/GFP-262、pCXCR4miR/GFP-713、pCXCR4miR/GFP-961）的CXCR4蛋白表达量显着下降;半定量RT-PCR显示3个重组质粒CXCR4的mRNA的表达量下降显着,尤以转染pCXCR4miR/GFP-713明显,选用pCXCR4miR/GFP-713用于后续实验。4.MTT比色法检测细胞的增殖,实验组（转染pCXCR4miR/GFP-713的Hep-2组）的细胞的增殖弱于空白对照组（Hep-2组）和阴性对照组（空质粒组）,且差别具有显着性（P<0.01）。5.流式细胞仪检测显示实验组细胞凋亡率明显高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。6.体外粘附实验显示实验组细胞30、60、90、120分钟时的粘附抑制率分别为27.7%、28.9%、25.6%、31.1%,粘附抑制率均高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。7.半定量RT-PCR结果显示实验组VEGF与E-CD mRNA的相对表达水平分别为0.752±0.008, 0.815±0.010,与对照组比较,VEGFmRNA相对表达水平下降（P<0.05）,E-CD mRNA相对表达水平上升（P<0.05）。8.Transwell小室体外侵袭实验显示细胞体外侵袭能力明显降低,实验组的细胞（30±4.119）与阴性对照组（69±6.437）及空白对照组（72±4.535）相比穿膜细胞数明显减少（P<0.01）。结论:CXCR4在喉癌组织中高表达并与喉癌的淋巴结转移、病理分化程度有关。RNA干涉沉默CXCR4基因可影响喉癌Hep-2细胞株增殖、凋亡、粘附和侵袭,CXCR4基因可以作为喉癌基因治疗的靶点,为喉癌的基因治疗提供一条新的途径。
李绍青[9]（2009）在《BZAP45基因与黏液表皮样癌关系的研究》文中进行了进一步梳理人涎腺黏液表皮样癌（Mucoepidermoid Carcinoma,MEC）是涎腺最常见的恶性肿瘤,约占涎腺恶性肿瘤的30%,尽管有时表现像良性病变,生长比较慢,但是该肿瘤有时是高度恶性而且预后很差。低分化的涎腺黏液表皮样癌侵袭和转移能力强,5年的存活率不超过43%。对于BZAP45（或BZW1）基因的相关研究的文献不多。至今仅知BZAP45是一种调节因子。而对于BZAP45基因是否有其他功能并没有文献报道,也未见有BZAP45基因与肿瘤相关的报道。RNA干扰（RNA interference, RNAi）作用机制为应用小的双链RNA引发序列特异性的基因表达的“沉默”或“敲除”。在哺乳动物细胞中这种双链RNA可以是短发夹结构RNA （Small hairpin RNA,shRNA）;也可以是3’-端带有游离碱基的简单的二聚体（Small interference RNA, siRNA）。转染合成的siRNA所得到的靶基因抑制效果往往时间比较短,而且局限于容易转染的细胞系。应用于RNA干扰的载体有很多种,而利用慢病毒构建载体应用于基因沉默,是研究基因功能很好的方法。在本课题的前期研究中,我们初步发现在黏液表皮样癌组织和细胞中,BZAP45均高表达。在此基础上,本课题构建了BZAP45慢病毒干涉载体,将Mc3细胞中的BZAP45基因沉默,观察其体外和体内生物学特性的改变,并对其影响Mc3细胞生物学行为的机制进行初步探索。本课题主要的研究内容包括以下几个方面:1.进一步确认BZAP45基因在黏黏液表皮样癌中高表达为验证基因芯片结果正确与否并且明确BZAP45基因是否为黏液表皮样癌特异性的差异表达基因,我们设计了BZAP45基因实时定量PCR的引物,进行实时定量PCR检测;并预制了BZAP45基因的多克隆抗体,对4例肿瘤组织（制备成15个样本）和4例正常组织进行了免疫组化染色。结果显示,BZAP45基因在黏液表皮样癌细胞和组织中表达均比正常细胞和组织高。2. BZAP 45基因RNA干扰慢病毒载载体的制备及黏黏液液表皮样癌细细胞胞感染针对靶基因序列,利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则,设计4个针对BZAP45基因的RNA干扰靶点序列;合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的载体上,将连接好的产物转入制备好的感受态细胞,对长出的阳性克隆先进行PCR鉴定,再进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的BZAP45基因RNA干扰慢病毒载体。选择干涉效果最好的序列,经过病毒的小量包装、大量包装、滴度检测及浓缩后获得足够滴度的慢病毒溶液,利用慢病毒载体感染Mc3细胞,利用有限稀释法挑选阳性单克隆,并利用时定量PCR对获得的细胞进行鉴定,从而获得了稳定感染的细胞株。3. BZAP 45基因干涉后Mc3细胞体体体外外及及体体内内生生物物学学行为的改变为了研究BZAP45基因在Mc3细胞中可能的作用,我们将BZAP45基因干涉,使其沉默后,利用MTT法、细胞计数法、平板克隆形成实验观、细胞划痕实验、transwell实验、HE染色、透射电镜等方法察Mc3细胞体外的生物学行为的变化情况,利用裸鼠移植瘤方法观察了Mc3细胞干涉前后在裸鼠体内的生长情况。结果显示,BZAP45基因沉默后,Mc3细胞体外增殖变缓,细胞的群体倍增时间由原来的约23 h增为约48 h;克隆形成能力下降,克隆形成率由原来的78%下降为20%;体外迁移能力下降,Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三种细胞迁移的距离分别为65.833±4.940μm、64.733±2.684μm和45.667±3.066μm;体外侵袭能力下降,Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三种细胞到达小室底面的细胞数分别为85±6.1、82.0±7.8和24.0±3.7个;细胞超微结构改变,干涉后细胞核染色质浓缩、碎裂、边集于核膜,呈境界清楚的块状或半月状;体内成瘤速度变缓,抑瘤率约为57.95%。4. BZAP 45影响MMCC 3细细细胞胞胞生生生物物物学学行行为为的的机机制初探为研究BZAP45影响MC3细胞生物学行为的机制,我们利用流式细胞仪检测了干涉前后细胞周期分布的改变,并利用免疫荧光检测了细胞周期相关因子、凋亡相关因子以及细胞增殖相关因子的表达改变,结果显示,BZAP45基因干涉后,细胞出现G1期阻滞,干涉前后p53、c-myc和P21的表达无明显变化;干涉后,caspase3的表达有所升高,而cyclin-D1和PCNA的表达有所降低。结论:1. BZAP45基因在黏液表皮样癌组织和细胞中高表达。2.成功构建了BZAP45基因干涉的慢病毒干涉载体。并成功将MC3细胞的BZAP45基因干涉,获得了稳定的细胞株。3. BZAP45基因被干涉后,Mc3细胞的体内和体外的生物学特性发生改变,细胞的恶性程度下降。4.BZAP45基因可能与黏液表皮样癌的发生和/或发展有关。
高玲[10]（2008）在《STAT3及ErbB2 RNA干涉结合放疗治疗脑胶质瘤的实验研究》文中研究说明脑肿瘤又称颅内肿瘤,是一种起病缓慢并逐渐加重的脑部疾病。原发性颅内肿瘤以胶质瘤最为多见,约占总数的40%。目前临床脑肿瘤的治疗手段主要包括手术治疗、放射治疗和化学药物治疗。由于采用单个治疗方法往往达不到理想的疗效,因此,在治疗时常常联合应用手术及放、化疗。而术后的放化疗效果将对患者的预后起着至关重要的影响,因此如何增加放疗化疗的敏感性以增强放化疗效果是目前研究的焦点。此外,在常规手段治疗脑肿瘤的过程中,肿瘤组织周围的正常组织在治疗时不可避免地会遭受损伤,最理想的治疗方法是只杀伤肿瘤细胞,而对正常产生较小的影响。RNAi具有高度的序列专一性,可以特异地使特定基因沉默,因此在治疗由于某个基因表达异常增高引起的疾病中非常有用。肿瘤的发生常常与原癌基因的表达异常增高相关,此时,利用RNAi技术下调这些异常高表达的基因,可特异性的影响肿瘤细胞,而对正常细胞无损伤,在实际研究过程中,找到符合要求的靶基因是获得理想治疗效果的关键。STAT3（信号转导子和转录激活子3）属于STATS蛋白家族。STATs是一类存在于胞浆中的由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子,共有七个同源家族成员。STAT3在多种肿瘤组织中呈现持续性激活状态,在肿瘤的演变和恶化的过程中起着重要的作用。此外,STAT3还对人肺腺癌和直肠癌的放化疗敏感性有影响。ErbB2是位于细胞表面的受体酪氨酸激酶ErbB家族成员。ErbB家族还包括EGF-R（ErbB1）,ErbB3和ErbB4。目前研究表明,许多肿瘤细胞系中的ErbB2呈高表达状态,并且ErbB2已经被用来作为乳腺癌病理分级指标参数和预后指标。Ricardo等还发现,ErbB2表达下调可以提高肿瘤细胞的辐射敏感性。众所周知,细胞增殖力增强将使肿瘤体积增大,细胞凋亡增强则将减小肿瘤体积,因此肿瘤体积改变的实质是细胞增殖和凋亡的动态平衡的最后外在体现。已有研究表明,STAT3和ErbB2对多种肿瘤细胞增殖力的维持具有重要作用。基于二者在肿瘤细胞中特异性高表达并且具有促进细胞增殖的功能,以及二者与肿瘤细胞放化疗敏感性的关系,因此本研究拟以STAT3和ErbB2为靶点应用RNAi技术、联合放疗治疗探索治疗恶性脑胶质瘤的新途径。在本论文中,我们主要进行了以下四个方面的研究:一.STAT3和ErbB2干涉载体的构建、筛选和干涉效果的确定设计STAT3和ErbB2干涉的靶位点以及GFP对照靶位点,利用pSilence2.1-U6-H1载体,构建pSilence2.1-U6-STAT3,pSilence2.1-U6-ErbB2,pSilence2.1-U6-GFP质粒,转染人脑胶质瘤U251细胞。经Western Blot和Real-Time PCR实验验证表明:与对照组相比,实验组细胞靶蛋白和靶mRNA表达水平都降低了8～14倍。二.STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi抑制细胞增殖的协同作用及其与放疗的联合效果克隆形成率是衡量细胞状态和增殖能力的金标准。在研究细胞辐射敏感性时,也通常要求使用克隆形成率来进行判断。为了确定本研究中使用的放疗剂量,我们首先用不同剂量60Coγ射线照射U251细胞,随后对其进行克隆形成率实验,根据实验结果,确定2Gy为治疗用照射剂量。同时使用MTT方法检测不同剂量60Coγ射线照射后U251细胞的增殖能力,结果与克隆形成率实验一致。我们将实验分为control组、pSilence2.1-GFP组、pSilence2.1-STAT3组、pSilence2.1-ErbB2组、pSilence2.1-STAT3+pSilence2.1-ErbB2组、control+2Gy组、pSilence2.1-GFP+2Gy组、pSilence2.1-STAT3+2Gy组、pSilence2.1-ErbB2+2Gy组以及pSilence2.1-STAT3+pSilence2.1-ErbB2+2Gy组,共10组,用克隆形成率实验检测各种处理对细胞增殖能力的影响。结果表明:（1）STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi均能抑制U251细胞增殖,且二者具有协同作用;（2）STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi均能增加U251细胞的辐射敏感性,将二者同时进行干涉时,U251细胞的辐射敏感性进一步增强。三.STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi对U251细胞凋亡及细胞周期的影响肿瘤发生的主要原因是细胞周期失调后导致的细胞无限制增殖。那么,转染pSilence2.1-STAT3和pSilence2.1-ErbB2后,什么原因致使星形胶质瘤细胞U251的增殖得到控制了呢?二者对正常星形胶质细胞的增殖是否有同样的影响呢?为了帮助弄清这两个问题,使用出生24小时内大鼠,分离培养原代星形胶质细胞（命名为NA细胞）,供研究使用。接下来,利用Hoechst 33258染色,观察到U251细胞在转染pSilence2.1-STAT3或pSilence2.1-ErbB2后24h,即出现了细胞凋亡特异的核浓缩现象,并随时间推移而加重,同时出现DNA lader现象。NA细胞在转染pSilence2.1-STAT3或pSilence2.1-ErbB2后无核浓缩现象。同时我们使用Annexin-V试剂盒和流式细胞仪定量检测了凋亡的发生,结果表明:U251细胞在转染pSilence2.1-STAT3后出现明显的凋亡,并且细胞凋亡呈时间依赖性,在48h凋亡细胞数量达最高峰,约为总数的50%。而在转染pSilence2.1-ErbB2后,U251细胞在12h和24h时都无显着凋亡发生,而在48h时出现非常显着的细胞凋亡。NA细胞在转染pSilence2.1-STAT3或pSilence2.1-ErbB2后,48h内没有出现显着的细胞凋亡。流式细胞仪细胞周期检测结果表明:转染pSilence2.1-STAT3或pSilence2.1-ErbB2 12h时,细胞都出现S期和G2-M期阻滞,24h时细胞都出现G0-G1期阻滞,36h时,二者都为S期阻滞,并且G2-M期细胞百分比数都为0,可见细胞已停止分裂。四.STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi诱导U251细胞凋亡机制的研究为了进一步确定STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi诱导凋亡的机制,进一步测定了转染后不同时间点U251细胞以及NA细胞的caspase3/7、caspase8和caspase9的水平;Caspase抑制剂Z-VAD-FMK以及Caspase3/7抑制剂AC-DEVD-CHO加入后,凋亡发生的水平;利用JC-1探针测定线粒体膜电位水平,Caspase抑制剂Z-VAD-fmk以及caspase3/7抑制剂AC-DEVD-CHO加入后,线粒体膜电位水平;DCF探针测定ROS水平;MDA试剂盒测定丙二醛水平;彗星电泳实验测定DNA双链断裂;Western Blot检测凋亡相关蛋白水平。研究结果证明:（1）STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi诱导U251细胞凋亡进程中激活caspase3/7,并能够引起线粒体膜电位明显降低。Caspase抑制剂Z-VAD-fmk可明显抑制caspase3/7活化,并抑制大部分细胞凋亡,可减弱线粒体膜电位降低的水平,这些都提示STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi诱导的细胞凋亡为caspase依赖性细胞凋亡。（2）进一步发现STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi后,同时存在线粒体途径凋亡和死亡受体途径凋亡,caspase8和caspase9的水平均有增高,且均能被Z-VAD和AC-DEVD-CHO大部分回复。（3）发现STAT3 RNAi诱导U251细胞凋亡过程中,伴随有ROS升高,ErbB2 RNAi诱导U251细胞凋亡过程中,伴随有MDA水平升高,均出现DNA双链断裂现象,提示凋亡与DNA损伤、ROS升高和膜损伤可能有关。（4）发现STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi诱导U251细胞凋亡过程中,bcl2蛋白以及survivin蛋白表达降低。本研究的创新之处在于:利用肿瘤组织高表达,而正常组织表达较低的核转录因子STAT3和膜受体酪氨酸激酶ErbB2为靶点治疗,结合放疗,提高U251辐射敏感性的复合治疗方法,比起单一方法治疗,更有针对性,可见到更明显的治疗效果。
二、RNA干涉在肿瘤研究中的应用进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNA干涉在肿瘤研究中的应用进展（论文提纲范文）
（1）三氧化二砷抑制肝癌转移及肝癌干细胞的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 三氧化二砷对肝癌转移及肝癌干细胞的作用研究 |
| 第一章 三氧化二砷在小鼠模型中抑制肝癌发生、转移并延长小鼠生存期 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 三氧化二砷抑制肝癌细胞在NOD/SCID小鼠皮下成瘤的能力 |
| 1.3.2 三氧化二砷在肝脏原位荷瘤小鼠模型中抑制肝癌肺转移 |
| 1.3.3 三氧化二砷显着改善肝脏原位荷瘤小鼠的生存状态,延长小鼠生存期 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 三氧化二砷抑制肝癌干细胞相关的生物学特性及功能 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 三氧化二砷对肝癌细胞体外作用的浓度确定 |
| 2.3.2 三氧化二砷降低肿瘤干细胞标志阳性的肝癌细胞比例 |
| 2.3.3 三氧化二砷下调干性基因及肝癌恶性预后标志的表达 |
| 2.3.4 三氧化二砷提高肿瘤干细胞样肝癌细胞对化疗药物的敏感性 |
| 2.3.5 三氧化二砷抑制肝癌干细胞的肿瘤球形成能力 |
| 2.3.6 三氧化二砷抑制肝癌细胞的transwell侵袭能力 |
| 2.4 小结 |
| 第二部分 三氧化二砷作用于肝癌细胞的靶分子探究 |
| 第三章 MCM7是三氧化二砷对肝癌干细胞发挥抑制作用的关键靶点 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利用表达谱芯片筛选三氧化二砷在肝癌细胞中调控的关键基因 |
| 3.3.2 三氧化二砷在细胞水平及小鼠皮下肿瘤中显着下调MCM7蛋白的表达 |
| 3.3.3 MCM7的敲低表达可重复三氧化二砷对肝癌转移的抑制作用 |
| 3.3.4 敲低MCM7的表达可再现三氧化二砷对肝癌干细胞的抑制作用 |
| 3.3.5 MCM7过表达抵消三氧化二砷对肝癌细胞成球的抑制作用 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 MCM7是肝癌进展与不良预后的重要标志 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 MCM7蛋白在人肝癌组织的亚细胞定位不同于癌旁组织 |
| 4.3.2 MCM7在人肝癌组织中高表达且表达量与肝癌分级呈正相关 |
| 4.3.3 MCM7在肝癌组织的核内相对表达量与肝癌进展及不良预后密切相关 |
| 4.4 小结 |
| 第三部分 三氧化二砷对MCM7分子表达调控机制的探究 |
| 第五章 三氧化二砷直接结合MCM7蛋白但与诱导蛋白降解无关 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 有机砷荧光探针在体外与重组人MCM7蛋白结合 |
| 5.3.2 有机砷荧光探针与肝癌细胞内源性MCM7蛋白结合 |
| 5.3.3 MCM7蛋白在三氧化二砷的作用下并未发生降解 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 三氧化二砷通过抑制SRF/MCM7 复合物下调MCM7 的表达 |
| 6.1 材料与试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 SRF与 MCM7 在肝癌细胞中形成复合物 |
| 6.3.2 SRF与 MCM7 启动子区域结合并调控MCM7 的表达水平 |
| 6.3.3 三氧化二砷抑制SRF/MCM7 复合物对MCM7 的转录调控 |
| 6.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 实验仪器设备 |
| 附录2 抗体信息及用量 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附 Cell Death and Disease 论文全文 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（2）以AKR1C3为靶点的核酸纳米粒子的构建及其靶向抑制去势抵抗性前列腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 去势抵抗性前列腺癌的研究进展 |
| 1.1.1 概况 |
| 1.1.2 治疗现状 |
| 1.2 AKR1C3 在去势抵抗性前列腺癌发生、发展和耐药中的作用 |
| 1.2.1 AKR1C3 概述 |
| 1.2.2 AKR1C3在PCa进展,转移和耐药中的作用 |
| 1.2.3 AKR1C3在PCa进展、转移、耐药中的作用机制 |
| 1.2.4 AKR1C3 抑制剂的研究 |
| 1.3 CRPC核酸靶向治疗的进展 |
| 1.3.1 核酸类药物解决靶向的进展 |
| 1.3.2 Aptamer肿瘤靶向治疗中的应用 |
| 1.3.3 适配体在各方面的应用 |
| 1.3.4 适配体在临床试验中的最新成果 |
| 1.3.5 结语与展望 |
| 第2章 核酸纳米粒子的构建及表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要药品与试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 核酸纳米粒子的理论基础及实验步骤 |
| 2.3.2 靶向性核酸纳米粒子(PPA/siRNA)表征 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 核酸纳米粒子载体的细胞安全性评价 |
| 2.4.2 选择有效siRNA序列 |
| 2.4.3 核酸纳米粒载体有效结合siRNA |
| 2.4.4 核酸纳米粒子载体(PP)的核磁表征 |
| 2.4.5 核酸纳米粒子(PPA-siRNA)的形貌表征 |
| 2.4.6 核酸纳米粒子(PPA-siRNA)的粒径(size)和电位(zeta)表征 |
| 第3章 核酸纳米粒子的细胞靶向性和有效性评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要药品与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞活性检测 |
| 3.3.3 siRNA转染 |
| 3.3.4 质粒扩增和提取 |
| 3.3.5 质粒转染 |
| 3.3.6 EdU法检测细胞增殖 |
| 3.3.7 细胞蛋白的提取 |
| 3.3.8 蛋白免疫印迹(Western Blot,WB) |
| 3.3.9 核酸纳米载体的体外靶向性评价实验方案 |
| 3.3.10 核酸纳米粒子的体外靶向性评价实验方案 |
| 3.3.11 核酸纳米粒子对前列腺癌细胞增殖有效性实验方案 |
| 3.4 实验结果 |
| 第4章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及取得科研成果 |
| 致谢 |
（3）细胞程序性坏死抵抗参与肺癌顺铂耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 顺铂诱导肺癌细胞程序性坏死及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 PITPα与 MLKL相互作用参与调控程序性坏死 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 程序性坏死抵抗促进肺癌细胞顺铂耐药及调控机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结及主要创新点 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（4）GADD45α抑制大鼠肝癌细胞CBRH-7919增殖的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肝癌的研究进展 |
| 1.2 诱发肝癌的主要风险因素 |
| 1.2.1 乙型肝炎病毒感染 |
| 1.2.2 丙型肝炎病毒的感染 |
| 1.2.3 基因组不稳定性 |
| 1.2.4 染色体不稳定性和癌基因 |
| 1.2.5 体细胞中的基因突变 |
| 1.2.6 异常的表观遗传修饰 |
| 1.3 GADD45α的研究进展 |
| 1.4 GADD45α的表达调节机制 |
| 1.5 GADD45α与肿瘤 |
| 1.6 MC-LR的概述 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 1.8 研究方案 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 质粒 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 实验主要试剂及其配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 GADD45α在 TCGA数据库中的生存分析及其表达 |
| 2.3.3 BRL-3A的恶性转化 |
| 2.3.4 慢病毒包装和侵染CBRH-7919 细胞 |
| 2.3.5 干涉片段转染CBRH-7919 细胞,敲低基因表达 |
| 2.3.6 MTT法检测细胞活力 |
| 2.3.7 Edu法检测细胞增殖 |
| 2.3.8 划痕实验检测细胞侵袭转移能力 |
| 2.3.9 Transwell迁移实验检测CBRH-7919 细胞迁移能力 |
| 2.3.10 Transwell侵袭实验检测CBRH-7919 细胞侵袭能力 |
| 2.3.11 软琼脂克隆形成试验检测细胞恶性能力 |
| 2.3.12 PI单染法检测细胞周期 |
| 2.3.13 流式细胞法检测CBRH-7919 细胞凋亡 |
| 2.3.14 qRT-PCR检测基因的表达 |
| 2.3.15 Western Blot检测蛋白的表达情况 |
| 2.3.16 统计分析 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 3.1 实验结果 |
| 3.1.1 GADD45α在肿瘤数据库中的生存分析和差异表达 |
| 3.1.2 鉴定MC-LR诱导的恶性转化细胞 |
| 3.1.3 GADD45α在 MC-LR诱导的BRL-3A恶性转化细胞中的表达情况 |
| 3.1.4 CBRH-7919 细胞中GADD45α的过表达 |
| 3.1.5 GADD45α表达变化对CBRH-7919 细胞活力的影响 |
| 3.1.6 GADD45α表达变化对CBRH-7919 细胞增殖的影响 |
| 3.1.7 GADD45α表达变化对CBRH-7919 侵袭转移能力的影响 |
| 3.1.8 GADD45α表达变化对CBRH-7919 恶性能力的影响 |
| 3.1.9 GADD45α表达变化对CBRH-7919 细胞周期的影响 |
| 3.1.10 GADD45α表达变化对CBRH-7919 细胞凋亡的影响 |
| 3.1.11 GADD45α表达变化对大鼠肝癌细胞CBRH-7919 信号通路相关基因表达的影响 |
| 3.2 讨论 |
| 3.3 小结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间参加的科研项目和发表的论文 |
| 致谢 |
（5）TNK2基因剪接异构体variant 1的表达变化影响乳腺癌癌性进展（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 一、基因的选择性剪接研究进展 |
| (一)选择性剪接的概述 |
| (二)选择性剪接的类型 |
| (三)选择性剪接的生理意义 |
| (四)选择性剪接与疾病 |
| 二、TNK2基因研究现状 |
| (一)TNK2基因结构 |
| (二)TNK2蛋白结构与功能 |
| (三)TNK2基因与肿瘤 |
| 三、乳腺癌研究进展 |
| (一)乳腺癌简述 |
| (二)乳腺癌的分子分型 |
| (三)乳腺癌相关基因 |
| 四、乳腺癌与TNK2 基因的联系 |
| (一)TNK2 基因影响乳腺癌细胞增殖 |
| (二)TNK2 基因影响乳腺癌细胞凋亡 |
| (三)TNK2 基因影响乳腺癌细胞迁移 |
| 五、本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 一、实验仪器和耗材 |
| (一)主要仪器及设备 |
| (二)实验耗材 |
| 二、实验试剂 |
| (一)分子生物学实验相关试剂 |
| (二)Western blot相关试剂 |
| (三)细胞培养相关试剂 |
| 三、实验材料 |
| (一)实验相关细胞株 |
| (二)实验相关抗体 |
| 四、实验方法 |
| (一)TNK2 基因Variant1 及其siRNA的引物设计 |
| (二)细胞RNA的提取和PCR |
| (三)细胞培养相关实验 |
| (四)Western Blot免疫印迹法 |
| (五)MTT法检测细胞活力 |
| (六)BrdU法检测细胞增殖能力 |
| (七)划痕法检测细胞迁移能力 |
| (八)Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力 |
| (九)细胞平板克隆形成实验 |
| (十)软琼脂集落形成实验 |
| (十一)DAPI染色检测细胞凋亡 |
| (十二)流式细胞术检测细胞周期及凋亡 |
| (十三)统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 一、验证TNK2 基因剪接异构体在乳腺癌中的表达情况 |
| 二、验证TNK2 基因Variant1 的干涉效果 |
| 三、TNK2 基因Variant1 表达对乳腺癌增殖周期的影响 |
| (一)BrdU法检测细胞增殖能力 |
| (二)MTT法检测细胞活力 |
| (三)流式细胞术检测细胞周期 |
| (四)Western Blot免疫印迹法检测周期相关蛋白 |
| 四、TNK2 基因Variant1 表达对乳腺癌迁移进程的影响 |
| (一)划痕实验检测细胞迁移能力 |
| (二)Transwell小室检测细胞迁移能力 |
| (三)Transwell小室检测细胞侵袭能力 |
| (四)Western Blot免疫印迹法检测迁移相关蛋白 |
| 五、TNK2 基因Variant1 表达对乳腺癌凋亡的影响 |
| (一)DAPI染色法检测细胞凋亡 |
| (二)流式细胞术检测细胞凋亡 |
| (三)Western Blot免疫印迹法检测凋亡相关蛋白 |
| 六、TNK2 基因Variant1 表达对乳腺癌克隆形成能力的影响 |
| (一)细胞平板克隆形成实验验证细胞癌性 |
| (二)软琼脂集落形成实验验证细胞癌性 |
| 第四章 分析讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）RNA干涉抑制STAT3基因诱导口腔鳞癌细胞发生凋亡的体内外实验研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 第1节 口腔鳞癌及其治疗 |
| 1 口腔鳞癌简介 |
| 2 口腔鳞癌的治疗 |
| 第2节 STAT3 基因的研究进展 |
| 1 STAT 家族及STAT3 的结构 |
| 2 STAT3 的活化 |
| 3 STAT3 的功能 |
| 4 STAT3 诱发肿瘤 |
| 5 对STAT3 的抑制方式 |
| 第3节 STAT3 相关的RNAI |
| 1 RNAi 概述 |
| 2 RNAi 技术在口腔癌治疗中的相关应用 |
| 第2章 实验研究 |
| 第1节 STAT3 在人口腔鳞状细胞癌组织中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第2节 PSILENCER1.0-U6-STAT3-SIRNA 重组质粒的构建与体外实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第3节 体内实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 体内实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第3章 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）靶向VEGF基因的siRNA对HeLa细胞中VEGF表达和细胞增殖的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 一、血管生成与肿瘤 |
| （一） 血管生成 |
| （二） 血管生成与肿瘤的关系 |
| 二、血管内皮生长因子的结构功能及与肿瘤的关系 |
| （一） 血管内皮生长因子 |
| （二） 血管内皮生长因子与肿瘤的关系 |
| （三） 血管内皮生长因子与肿瘤的治疗 |
| 三、RNA 干涉（RNA INTERFERENCE，RNAI） |
| （一） RNA 干涉现象的发现 |
| （二） RNAi 的作用机制 |
| （三） RNAi 技术在基因研究上的历史突破 |
| （四） RNAi 技术在肿瘤基因治疗中的应用 |
| 四、宫颈癌的研究进展 |
| （一） 宫颈癌简介 |
| （二） 血管内皮生长因子在宫颈癌中的表达及其作用 |
| （三） RNAi 在宫颈癌基因治疗中的应用 |
| 第二章 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| （一） 实验材料 |
| （二） 主要仪器 |
| 二、实验方法 |
| （一） 哺乳动物细胞培养 |
| （二） 大量制备质粒的方法 |
| （三） 哺乳动物细胞电穿孔法转染 |
| （四） 瞬时转染 |
| （五） 稳定转染 |
| （六） 哺乳动物细胞总 RNA 的提取 |
| （七） 逆转录 PCR (RT-PCR) |
| （八） SDS-PAGE 电泳及Western Blotting |
| （九） 酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA） |
| （十） MTT 法 |
| （十一） 流式细胞仪检测细胞增殖 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 一、瞬时转染VEGF 干涉质粒 |
| （一） 质粒 |
| （二） 质粒的大量制备及酶切鉴定 |
| （三） RT-PCR 鉴定干涉质粒对VEGF 表达的干涉效果 |
| 二、稳定表达VEGF SIRNA 的细胞株的建立 |
| （一） 稳定转染细胞株的筛选 |
| （二） RT-PCR 鉴定 |
| 三、RNA 干涉对细胞 VEGF 表达的影响 |
| （一） RNAi 对细胞内VEGF mRNA 表达的影响 |
| （二） RNAi 对VEGF 蛋白表达的影响 |
| 四、靶向VEGF 的SIRNA 对细胞增殖的影响 |
| （一） MTT 法检测RNAi 对细胞增殖的影响 |
| （二） 流式细胞仪检测 RNAi 对细胞增殖的影响 |
| 讨论 |
| 一、VEGF 基因的干涉靶点确定 |
| 二、稳定转染细胞系的建立 |
| 三、靶向VEGF 的SIRNA 抑制细胞增殖的机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（8）RNA干涉沉默CXCR4基因对喉癌侵袭、转移的相关性实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩写词 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 文献综述之一 CXCR4 综述 |
| 文献综述之二 miRNA 综述 |
| 第二章 CXCR4 在喉癌组织中的表达及意义 |
| 一 材料和方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 第三章 CXCR4 shRNAmir 真核表达质粒的构建 |
| 一 材料和方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 第四章 RNA 干涉沉默CXCR4 基因对喉癌Hep-2 细胞株增殖、凋亡、粘附和侵袭的影响 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
（9）BZAP45基因与黏液表皮样癌关系的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 免疫组织化学及 Real-time PCR 验证基因芯片结果 |
| 实验一 Real-time PCR 检测黏液表皮样癌组织和细胞及正常唾液腺组织和细胞中 BZAP45 的表达 |
| 实验二 免疫组织化学检测人黏液表皮样癌及正常唾液腺组织 BZAP45 表达 |
| 第二部分 BZAP45 基因 RNA 干扰慢病毒载体的制备及目的细胞感染 |
| 实验一 目的基因 RNAi 设计 |
| 实验二 vshRNA 载体的构建 |
| 实验三 慢病毒小量包装 |
| 实验四 RNA 干扰有效靶点筛选（RT-PCR 筛靶） |
| 实验五 慢病毒大包装实验 |
| 实验六 Mc3 细胞慢病毒感染 |
| 第三部分 BZAP45 沉默后Mc3 体外及体内生物学行为的改变 |
| 实验一 细胞计数 |
| 实验二 MTT 实验 |
| 实验三 平板克隆形成实验 |
| 实验四 细胞划痕实验 |
| 实验五 Transwell 实验 |
| 实验六 透射电镜 |
| 实验七 BZAP45 基因干涉后Mc3 体内生物学的改变 |
| 第四部分 BZAP45 影响MC3 细胞生物学行为的机制初探 |
| 实验一 细胞周期检测 |
| 实验二 免疫荧光检测相关因子的表达 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）STAT3及ErbB2 RNA干涉结合放疗治疗脑胶质瘤的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 STAT3和ErbB2干涉载体的构建、筛选和干涉效果的确定 |
| 1 实验材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi抑制细胞增殖的协同作用及其与放疗的联合效果 |
| 1 实验材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi对U251细胞凋亡及细胞周期的影响 |
| 1 实验材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 STAT3 RNAi和ErbB2 RNAi诱导U251细胞凋亡机制的研究 |
| 1 实验材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第五部分 体内研究部分 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 附图清单 |
| 2 附表清单 |
| 发表文章 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、RNA干涉在肿瘤研究中的应用进展（论文参考文献）
- [1]三氧化二砷抑制肝癌转移及肝癌干细胞的作用与机制研究[D]. 王海洋. 军事科学院, 2020(02)
- [2]以AKR1C3为靶点的核酸纳米粒子的构建及其靶向抑制去势抵抗性前列腺癌的实验研究[D]. 姚洲. 吉林大学, 2020(08)
- [3]细胞程序性坏死抵抗参与肺癌顺铂耐药的机制研究[D]. 荆琳. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [4]GADD45α抑制大鼠肝癌细胞CBRH-7919增殖的作用机制研究[D]. 李帅洪. 河南师范大学, 2019(07)
- [5]TNK2基因剪接异构体variant 1的表达变化影响乳腺癌癌性进展[D]. 李菁. 东北师范大学, 2017(05)
- [6]RNA干涉抑制STAT3基因诱导口腔鳞癌细胞发生凋亡的体内外实验研究[D]. 高扬. 吉林大学, 2011(09)
- [7]靶向VEGF基因的siRNA对HeLa细胞中VEGF表达和细胞增殖的影响[D]. 左丹. 东北师范大学, 2009(11)
- [8]RNA干涉沉默CXCR4基因对喉癌侵袭、转移的相关性实验研究[D]. 王海涛. 吉林大学, 2009(08)
- [9]BZAP45基因与黏液表皮样癌关系的研究[D]. 李绍青. 第四军医大学, 2009(12)
- [10]STAT3及ErbB2 RNA干涉结合放疗治疗脑胶质瘤的实验研究[D]. 高玲. 中国人民解放军军事医学科学院, 2008(11)